Ионообменная хроматография белков
Помимо карбоксильных катионитов, о которых шла речь выше, применяют катиониты, содержащие сульфогруппы —
, Например
сульфопропилсефадекс. В отличие от карбоксильных сульфогруппы сохраняют отрицательный заряд практически при всех рН, используемых в хроматографии белков.
Ионогенные группы фосфоцеллюлозы слабее, чем у сульфопропилсефадекса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионообменник может применяться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых ферментов фосфорного обмена.
Среди анионитов наибольшее распространение получили диэтил-амииоэтил (DEAE)-целлюлоза и ее аналоги с иными матрицами:
Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой полисахаридной матрице.
Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа несколько ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что ее р
равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как аннонообменник вплоть до рН 8,5 — 9,0. Аниониты, содержащие четвертичные аммонийные группы, — QAE-сефадекс или QAE-сефароза— сохраняют положительный заряд и при более высоких рH.
Хроматография белков иа DAEA-целлюлозе и аналогичных аниони-тах, подобно хроматографии на катионах, определяется многоточечным связыванием отрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катионными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах, десорбции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее можно проводить ступенчато или с применением градиента концентрации соли. И в этом случае не рекомендуют градиенты pH и использование растворов, содержащих разные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разноименно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемых анионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислых растворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг рH в щелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сделает процесс трудно контролируемым.
В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионообменники на основе гидрофильных органических полимеров, получаемых в форме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабочей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хроматографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых молекул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионообменников с неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что позволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонку при давлении порядка 20 атм. Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и скорость хроматографии белков на такого рода сорбентах, получившей название быстрой жидкостной хроматографии белков (английское сокращенное обозначение FPLC). В качестве сорбентов используют Moho-Q — сильный анионит с четвертичными аммонийными группами, Moho-S — сильный катионит, содержащий сульфогруппы, или Моно-P— катионит с фосфатными группами.
Смотрите также
Применение топлив, смазочных материалов и специальных жидкостей
...
Биологически активные добавки
...
Классификация методов АЭСА
После
получения спектра следующей операцией является его аполитическая оценка, которую
можно проводить объективным либо субъективным методом. Объективные методы можно
подразделить на непрямые и пря ...