Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гель, образующий материал не вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.

Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакриламидных материалах. В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в полисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.

Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хроматографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пептидов. — гидрофобное связывание с матрицей геля.

Гидрофобные элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности эпи-хлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилалаиина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.

Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать

3-5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.

Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография — удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.

В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять макропористые неорганические носители — макропористые стекло и силикагель. Обычно поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки по размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии.