Этапы определения АК последовательности в пептидах. Синтез белка
Предварительное освобождение каждого анализируемого пептида от примесей других.
1. Идентификация NH2- и СООН - концевых остатков.
2. Расщепление с помощью трипсина неповрежденной цепи на ряд более коротких пептидов (фрагментов).
3. Разделение фрагментов пептидов при помощи электрофореза или хроматографии.
4. Определяют NH2- и СООН- группы фрагментов.
5. Более длинные фрагменты анализируют, устанавливая первичную структуру.
6. Подвергают полипептид частичному гидролизу (химотрипсин, пепсин)
7. Сопоставляют аминокислотный состав в двух наборах пептидных компонентов.
Определена АК последовательность бычьего инсулина, молекула которого состоит из двух полипептидных цепей, содержащих А-21 и В-30 аминокислотных остатков, эти две цепи поперечно связаны -S-S- мостиками и имеют еще один такой мостик внутри цепи. также расшифрованы адренокортикотропин, рибонуклеаза, гемоглобин.
Видовая специфичность АК - инсулин у животных и человека. Цитохром С - белок переносчик электронов у всех животных, растений и микроорганизмов.
В настоящее время для количественного определения АК применяется реакция их с нингидрином. В первой стадии реакции нингидрин восстанавливается. В результате образуется аммиак, который во второй стадии реагирует с нингидрином, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (570 нм) пропорциональна количеству АК.
На основе нингидриновой реакции разработан метод хроматографии распределения на бумаге. Эта же реакция используется и в автоматическом анализаторе АК: после разделения на колонке, заполненной специальными ионообменными смолами, элюент из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина, интенсивность окраски измеряется на спектрофотометре и записывается в виде пиков. Смесь АК успешно разделяется и методом электрофореза на бумаге. При рН=6,0 хорошо разделяются кислые и основные АК с нейтральными. Отрицательно заряженные АК двигаются к аноду, а положительно - к катоду, нейтральные остаются на старте. После электрофореза АК выявляют с помощью химических реакций.
Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. В теле человека белки составляют 45% сухой массы. Помимо углерода (50-54%), кислорода (21,5-23,5%) и водорода (6,5-7,3%), входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков являются азот (15-17%), сера (0,3-2,5%) , в небольших количествах содержатся железо, марганец, фосфор, магний, йод.
Для исследования свойств белков, также как и для изучения их химического состава и строения необходимо получение их в химически индивидуальном состоянии.
Белковые вещества чувствительны к повышению температуры и к действию большинства химических реагентов. Белки выделяют при низкой (+4о С) температуре. Органы и ткани животных измельчают, гомогенизируют. Большинство белков тканей хорошо растворимы в 8-10% растворах солей. Для экстракции белков применяются буферные смеси с определенными значениями рН среды. Разделение смеси белков - фракционирование. Для этого используют различные методы: высаливание, хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез, ультрацентрифугирование и т.д.
Таким образом, основная структурная единица белка - мономер- аминокислота. Белки - высокомолекулярные, N-содержащие биомолекулы, состоящие в основном из аминокислот. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 до 1000000 и выше дальтон.
У огромного количества белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами для определения молекулярной массы являются методы седиментационного анализа (включая центрифугирование в градиенте плотности), хроматографии, гель-фильтрации и электрофореза.
Седиментационный анализ проводят в ультрацентрифугах и вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации (чем больше масса исследуемого вещества, тем меньше скорость осаждения).
Тонкослойная гель-фильтрация. Длина пробега белка (в мм) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка.
Величину и форму белковых молекул определяют благодаря применению методов сканирующей электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, что позволило в деталях расшифровать не только пространственную структуру, но и соответственно форму и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях.
В процессе жизнедеятельности организма белкам принадлежит особая роль, т.к. ни углеводы, ни липиды не могут их заменить в воспроизводстве основных структурных элементов клетки, а также в образовании таких важнейших веществ, как ферменты и гормоны. Однако синтез белка из неорганических веществ возможен только в растительных клетках. В животном организме белок синтезируется из аминокислот, часть которых образуется в самом организме, а другие АК в организмах не синтезируется и должны поступать с пищей. Поэтому биологическая ценность белков пищи определяется наличием в их составе всех АК.
Состояние белкового обмена организма зависит не только от количества принимаемого с пищей белка, но и от качественного его состава. Природные белки обладают неодинаковой пищевой ценностью. Поэтому для удовлетворения пластических потребностей организма требуются различные количества разных белков пищи. Чем ближе аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу белков тела, тем выше его биологическая ценность. Степень усвоения пищевого белка зависит также от степени гидролиза, распада его под влиянием ферментов желудочно-кишечного тракта. Ряд белковых веществ (шерсть, волосы, перья) несмотря на их близкий состав к белкам тела, почти не используются в качестве пищевого белка, поскольку они не гидролизуются протеиназами кишечника человека и большинства животных.
С понятием биологической ценности белков тесно связан вопрос о незаменимых АК. Живые организмы существенно различаются по способности синтезировать АК. Высшие позвоночные животные не синтезируют всех необходимых для синтетических целей АК.
В организме человека синтезируется только 10 из 20 АК белковой молекулы. Это - заменимые АК. Они могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме, они называются незаменимые аминокислоты.
Установлено, что незаменимость аминокислот для роста и развития организма животных и человека связана с отсутствием способность тканей синтезировать углеродные скелеты незаменимых АК, поскольку процесс аминирования кетопроизводных осуществляется легко с помощью реакций трансаминирования. для обеспечения нормальной жизнедеятельности все эти 10 АК должны поступать с пищей. Для взрослого человека аргинин и гистидин оказались частично заменимыми. Исключение незаменимых АК из пищевой смеси сопровождается развитием отрицательного азотистого баланса, слабости, нарушений со стороны нервной системы и т.д. Для человека белки мяса, молока, яиц биологически более ценны, поскольку их аминокислотный состав ближе к АК составу организма и тканей человека. Растительные белки содержат весь необходимый набор АК, но в другом соотношении. Поэтому для удовлетворения потребностей организма в белках их необходимо значительно больше.
Заменимые:
глицин, аланин, аспарагин, серин, тирозин, глутамин, пролин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин.
Незаменимые:
треонин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, глутамин и гистидин.
Следует особо подчеркнуть, что недостаток какой-либо одной незаменимой АК ведет к неполному усвоению и других АК. Следует учитывать и видовые различия незаменимости отдельных АК.
Белковые резервы.
Под термином резервные белки понимают не особые отложения белков, а легкомобилизуемые при необходимости тканевые белки, которые после гидролиза под действием тканевых протеиназ служат поставщиками АК, необходимых для синтеза ферментов и гормонов.
Наблюдения за больными в клинике свидетельствует о том, что при голодании или тяжелых инфекционных заболеваниях, когда наблюдается интенсивный распад органов, то в первую очередь снижается масса печени и мышц, без существенного изменения массы мозга и сердца. Организм как бы жертвует белками печени и мышц для обеспечения нормальной деятельности жизненно важных органов. Принято считать, что белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве “резервных”, хотя по своему существу резко отличаются от ресурсов углеводов (отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение жиров). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях имеет важное физиологическое значение.
Аминокислоты в организме подвергаются разнообразным превращениям, все они участвуют в процессе биосинтеза белка. Установлено, что носителями наследственной информации являются молекулы ДНК, на которых закодированы генетические особенности организма, в том числе состав и структура синтезируемых белков.
Первичная структура ДНК представляет собой определенную последовательность мононуклеотидов, каждые три из которых носят названия триплет и кодируют вполне определенную аминокислоту.
Смотрите также
Методы разделения иммуноглобулинов
Иммуноглобулины - основные защитные белки
организма, так как они обладают свойствами различных антител. Они содержатся
в крови, молозиве и молоке, слюне и других жидкостях. С их количест ...
Предисловие
В сказке «Алиса в Зазеркалье» – второй части знаменитой
детской дилогии Льюиса Кэрролла, ныне вошедшей в классику литературы для
взрослых, – есть забавное стихотворение (исполняемое Траляля, бр ...