|
Предварительное
освобождение каждого анализируемого пептида от примесей других.
1.
Идентификация NH2- и СООН - концевых остатков.
2.
Расщепление с помощью трипсина неповрежденной цепи на ряд более коротких
пептидов (фрагментов).
3.
Разделение фрагментов пептидов при помощи электрофореза или хроматографии.
4.
Определяют NH2- и СООН- группы фрагментов.
5. Более
длинные фрагменты анализируют, устанавливая первичную структуру.
6.
Подвергают полипептид частичному гидролизу (химотрипсин, пепсин)
7. Сопоставляют
аминокислотный состав в двух наборах пептидных компонентов.
Определена
АК последовательность бычьего инсулина, молекула которого состоит из двух
полипептидных цепей, содержащих А-21 и В-30 аминокислотных остатков, эти две
цепи поперечно связаны -S-S- мостиками и имеют еще один такой мостик внутри
цепи. также расшифрованы адренокортикотропин, рибонуклеаза, гемоглобин.
Видовая
специфичность АК - инсулин у животных и человека. Цитохром С - белок переносчик
электронов у всех животных, растений и микроорганизмов.
В настоящее
время для количественного определения АК применяется реакция их с нингидрином.
В первой стадии реакции нингидрин восстанавливается. В результате образуется
аммиак, который во второй стадии реагирует с нингидрином, образуя сине-фиолетовый
продукт, интенсивность окраски которого (570 нм) пропорциональна количеству АК.
На основе
нингидриновой реакции разработан метод хроматографии распределения на бумаге.
Эта же реакция используется и в автоматическом анализаторе АК: после разделения
на колонке, заполненной специальными ионообменными смолами, элюент из колонки
поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина, интенсивность
окраски измеряется на спектрофотометре и записывается в виде пиков. Смесь АК
успешно разделяется и методом электрофореза на бумаге. При рН=6,0 хорошо
разделяются кислые и основные АК с нейтральными. Отрицательно заряженные АК двигаются
к аноду, а положительно - к катоду, нейтральные остаются на старте. После
электрофореза АК выявляют с помощью химических реакций.
Наиболее
богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источником белка являются
также микроорганизмы и растения. В теле человека белки составляют 45% сухой
массы. Помимо углерода (50-54%), кислорода (21,5-23,5%) и водорода (6,5-7,3%),
входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным
компонентом белков являются азот (15-17%), сера (0,3-2,5%) , в небольших
количествах содержатся железо, марганец, фосфор, магний, йод.
Для
исследования свойств белков, также как и для изучения их химического состава и
строения необходимо получение их в химически индивидуальном состоянии.
Белковые
вещества чувствительны к повышению температуры и к действию большинства
химических реагентов. Белки выделяют при низкой (+4о С) температуре.
Органы и ткани животных измельчают, гомогенизируют. Большинство белков тканей
хорошо растворимы в 8-10% растворах солей. Для экстракции белков применяются
буферные смеси с определенными значениями рН среды. Разделение смеси белков -
фракционирование. Для этого используют различные методы: высаливание,
хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез, ультрацентрифугирование и т.д.
Таким
образом, основная структурная единица белка - мономер- аминокислота. Белки -
высокомолекулярные, N-содержащие биомолекулы, состоящие в основном из
аминокислот. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 до 1000000 и выше
дальтон.
У огромного
количества белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами
для определения молекулярной массы являются методы седиментационного анализа
(включая центрифугирование в градиенте плотности), хроматографии,
гель-фильтрации и электрофореза.
Седиментационный
анализ проводят в ультрацентрифугах и вычисляют молекулярную массу по скорости
седиментации (чем больше масса исследуемого вещества, тем меньше скорость
осаждения).
Тонкослойная
гель-фильтрация. Длина пробега белка (в мм) через тонкий слой сефадекса
находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка.
Величину и
форму белковых молекул определяют благодаря применению методов сканирующей
электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, что позволило в деталях
расшифровать не только пространственную структуру, но и соответственно форму и
степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях.
В процессе
жизнедеятельности организма белкам принадлежит особая роль, т.к. ни углеводы,
ни липиды не могут их заменить в воспроизводстве основных структурных элементов
клетки, а также в образовании таких важнейших веществ, как ферменты и гормоны.
Однако синтез белка из неорганических веществ возможен только в растительных
клетках. В животном организме белок синтезируется из аминокислот, часть которых
образуется в самом организме, а другие АК в организмах не синтезируется и
должны поступать с пищей. Поэтому биологическая ценность белков пищи
определяется наличием в их составе всех АК.
Состояние
белкового обмена организма зависит не только от количества принимаемого с пищей
белка, но и от качественного его состава. Природные белки обладают неодинаковой
пищевой ценностью. Поэтому для удовлетворения пластических потребностей
организма требуются различные количества разных белков пищи. Чем ближе
аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу
белков тела, тем выше его биологическая ценность. Степень усвоения пищевого
белка зависит также от степени гидролиза, распада его под влиянием ферментов
желудочно-кишечного тракта. Ряд белковых веществ (шерсть, волосы, перья)
несмотря на их близкий состав к белкам тела, почти не используются в качестве
пищевого белка, поскольку они не гидролизуются протеиназами кишечника человека
и большинства животных.
С понятием
биологической ценности белков тесно связан вопрос о незаменимых АК. Живые
организмы существенно различаются по способности синтезировать АК. Высшие позвоночные
животные не синтезируют всех необходимых для синтетических целей АК.
В организме
человека синтезируется только 10 из 20 АК белковой молекулы. Это - заменимые
АК. Они могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов.
Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме, они называются незаменимые
аминокислоты.
Установлено,
что незаменимость аминокислот для роста и развития организма животных и
человека связана с отсутствием способность тканей синтезировать углеродные
скелеты незаменимых АК, поскольку процесс аминирования кетопроизводных
осуществляется легко с помощью реакций трансаминирования. для обеспечения
нормальной жизнедеятельности все эти 10 АК должны поступать с пищей. Для
взрослого человека аргинин и гистидин оказались частично заменимыми. Исключение
незаменимых АК из пищевой смеси сопровождается развитием отрицательного
азотистого баланса, слабости, нарушений со стороны нервной системы и т.д. Для
человека белки мяса, молока, яиц биологически более ценны, поскольку их
аминокислотный состав ближе к АК составу организма и тканей человека.
Растительные белки содержат весь необходимый набор АК, но в другом соотношении.
Поэтому для удовлетворения потребностей организма в белках их необходимо
значительно больше.
Заменимые: глицин, аланин, аспарагин, серин, тирозин,
глутамин, пролин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин.
Незаменимые: треонин, валин, лейцин, изолейцин,
фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, глутамин и гистидин.
Следует
особо подчеркнуть, что недостаток какой-либо одной незаменимой АК ведет к
неполному усвоению и других АК. Следует учитывать и видовые различия
незаменимости отдельных АК.
Белковые
резервы. Под термином
резервные белки понимают не особые отложения белков, а легкомобилизуемые при
необходимости тканевые белки, которые после гидролиза под действием тканевых
протеиназ служат поставщиками АК, необходимых для синтеза ферментов и гормонов.
Наблюдения
за больными в клинике свидетельствует о том, что при голодании или тяжелых
инфекционных заболеваниях, когда наблюдается интенсивный распад органов, то в
первую очередь снижается масса печени и мышц, без существенного изменения массы
мозга и сердца. Организм как бы жертвует белками печени и мышц для обеспечения
нормальной деятельности жизненно важных органов. Принято считать, что белки
плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве “резервных”, хотя по
своему существу резко отличаются от ресурсов углеводов (отложение гликогена в
печени и мышцах) и липидов (отложение жиров). Существование в организме механизма
срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях имеет важное
физиологическое значение.
Аминокислоты
в организме подвергаются разнообразным превращениям, все они участвуют в
процессе биосинтеза белка. Установлено, что носителями наследственной
информации являются молекулы ДНК, на которых закодированы генетические
особенности организма, в том числе состав и структура синтезируемых белков.
Первичная
структура ДНК представляет собой определенную последовательность
мононуклеотидов, каждые три из которых носят названия триплет и кодируют вполне
определенную аминокислоту.
|
