Этапы определения АК последовательности в пептидах. Синтез белка

Информация для студентов / Этапы определения АК последовательности в пептидах. Синтез белка

Предварительное освобождение каждого анализируемого пептида от примесей других.

1. Идентификация NH2- и СООН - концевых остатков.

2. Расщепление с помощью трипсина неповрежденной цепи на ряд более коротких пептидов (фрагментов).

3. Разделение фрагментов пептидов при помощи электрофореза или хроматографии.

4. Определяют NH2- и СООН- группы фрагментов.

5. Более длинные фрагменты анализируют, устанавливая первичную структуру.

6. Подвергают полипептид частичному гидролизу (химотрипсин, пепсин)

7. Сопоставляют аминокислотный состав в двух наборах пептидных компонентов.

Определена АК последовательность бычьего инсулина, молекула которого состоит из двух полипептидных цепей, содержащих А-21 и В-30 аминокислотных остатков, эти две цепи поперечно связаны -S-S- мостиками и имеют еще один такой мостик внутри цепи. также расшифрованы адренокортикотропин, рибонуклеаза, гемоглобин.

Видовая специфичность АК - инсулин у животных и человека. Цитохром С - белок переносчик электронов у всех животных, растений и микроорганизмов.

В настоящее время для количественного определения АК применяется реакция их с нингидрином. В первой стадии реакции нингидрин восстанавливается. В результате образуется аммиак, который во второй стадии реагирует с нингидрином, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (570 нм) пропорциональна количеству АК.

На основе нингидриновой реакции разработан метод хроматографии распределения на бумаге. Эта же реакция используется и в автоматическом анализаторе АК: после разделения на колонке, заполненной специальными ионообменными смолами, элюент из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина, интенсивность окраски измеряется на спектрофотометре и записывается в виде пиков. Смесь АК успешно разделяется и методом электрофореза на бумаге. При рН=6,0 хорошо разделяются кислые и основные АК с нейтральными. Отрицательно заряженные АК двигаются к аноду, а положительно - к катоду, нейтральные остаются на старте. После электрофореза АК выявляют с помощью химических реакций.

Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. В теле человека белки составляют 45% сухой массы. Помимо углерода (50-54%), кислорода (21,5-23,5%) и водорода (6,5-7,3%), входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков являются азот (15-17%), сера (0,3-2,5%) , в небольших количествах содержатся железо, марганец, фосфор, магний, йод.

Для исследования свойств белков, также как и для изучения их химического состава и строения необходимо получение их в химически индивидуальном состоянии.

Белковые вещества чувствительны к повышению температуры и к действию большинства химических реагентов. Белки выделяют при низкой (+4о С) температуре. Органы и ткани животных измельчают, гомогенизируют. Большинство белков тканей хорошо растворимы в 8-10% растворах солей. Для экстракции белков применяются буферные смеси с определенными значениями рН среды. Разделение смеси белков - фракционирование. Для этого используют различные методы: высаливание, хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез, ультрацентрифугирование и т.д.

Таким образом, основная структурная единица белка - мономер- аминокислота. Белки - высокомолекулярные, N-содержащие биомолекулы, состоящие в основном из аминокислот. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 до 1000000 и выше дальтон.

У огромного количества белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами для определения молекулярной массы являются методы седиментационного анализа (включая центрифугирование в градиенте плотности), хроматографии, гель-фильтрации и электрофореза.

Седиментационный анализ проводят в ультрацентрифугах и вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации (чем больше масса исследуемого вещества, тем меньше скорость осаждения).

Тонкослойная гель-фильтрация. Длина пробега белка (в мм) через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от молекулярной массы белка.

Величину и форму белковых молекул определяют благодаря применению методов сканирующей электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа, что позволило в деталях расшифровать не только пространственную структуру, но и соответственно форму и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях.

В процессе жизнедеятельности организма белкам принадлежит особая роль, т.к. ни углеводы, ни липиды не могут их заменить в воспроизводстве основных структурных элементов клетки, а также в образовании таких важнейших веществ, как ферменты и гормоны. Однако синтез белка из неорганических веществ возможен только в растительных клетках. В животном организме белок синтезируется из аминокислот, часть которых образуется в самом организме, а другие АК в организмах не синтезируется и должны поступать с пищей. Поэтому биологическая ценность белков пищи определяется наличием в их составе всех АК.

Состояние белкового обмена организма зависит не только от количества принимаемого с пищей белка, но и от качественного его состава. Природные белки обладают неодинаковой пищевой ценностью. Поэтому для удовлетворения пластических потребностей организма требуются различные количества разных белков пищи. Чем ближе аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу белков тела, тем выше его биологическая ценность. Степень усвоения пищевого белка зависит также от степени гидролиза, распада его под влиянием ферментов желудочно-кишечного тракта. Ряд белковых веществ (шерсть, волосы, перья) несмотря на их близкий состав к белкам тела, почти не используются в качестве пищевого белка, поскольку они не гидролизуются протеиназами кишечника человека и большинства животных.

С понятием биологической ценности белков тесно связан вопрос о незаменимых АК. Живые организмы существенно различаются по способности синтезировать АК. Высшие позвоночные животные не синтезируют всех необходимых для синтетических целей АК.

В организме человека синтезируется только 10 из 20 АК белковой молекулы. Это - заменимые АК. Они могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируются в организме, они называются незаменимые аминокислоты.

Установлено, что незаменимость аминокислот для роста и развития организма животных и человека связана с отсутствием способность тканей синтезировать углеродные скелеты незаменимых АК, поскольку процесс аминирования кетопроизводных осуществляется легко с помощью реакций трансаминирования. для обеспечения нормальной жизнедеятельности все эти 10 АК должны поступать с пищей. Для взрослого человека аргинин и гистидин оказались частично заменимыми. Исключение незаменимых АК из пищевой смеси сопровождается развитием отрицательного азотистого баланса, слабости, нарушений со стороны нервной системы и т.д. Для человека белки мяса, молока, яиц биологически более ценны, поскольку их аминокислотный состав ближе к АК составу организма и тканей человека. Растительные белки содержат весь необходимый набор АК, но в другом соотношении. Поэтому для удовлетворения потребностей организма в белках их необходимо значительно больше.

Заменимые:

глицин, аланин, аспарагин, серин, тирозин, глутамин, пролин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин.

Незаменимые:

треонин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, глутамин и гистидин.

Следует особо подчеркнуть, что недостаток какой-либо одной незаменимой АК ведет к неполному усвоению и других АК. Следует учитывать и видовые различия незаменимости отдельных АК.

Белковые резервы.

Под термином резервные белки понимают не особые отложения белков, а легкомобилизуемые при необходимости тканевые белки, которые после гидролиза под действием тканевых протеиназ служат поставщиками АК, необходимых для синтеза ферментов и гормонов.

Наблюдения за больными в клинике свидетельствует о том, что при голодании или тяжелых инфекционных заболеваниях, когда наблюдается интенсивный распад органов, то в первую очередь снижается масса печени и мышц, без существенного изменения массы мозга и сердца. Организм как бы жертвует белками печени и мышц для обеспечения нормальной деятельности жизненно важных органов. Принято считать, что белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве “резервных”, хотя по своему существу резко отличаются от ресурсов углеводов (отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение жиров). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях имеет важное физиологическое значение.

Аминокислоты в организме подвергаются разнообразным превращениям, все они участвуют в процессе биосинтеза белка. Установлено, что носителями наследственной информации являются молекулы ДНК, на которых закодированы генетические особенности организма, в том числе состав и структура синтезируемых белков.

Первичная структура ДНК представляет собой определенную последовательность мононуклеотидов, каждые три из которых носят названия триплет и кодируют вполне определенную аминокислоту.

    Смотрите также

    Отравляющие вещества
    ...

    Приложение 5
    Добыча нефти включая газовый конденсат, за 1993 г. в тоннах (по компаниям) Российская Федерация                     339653933 Западная Сибирь                             237353903 Тюмень     ...

    Планирование дискриминирующих экспериментов
    Для дискриминации гипотез используют эксперименты различного типа. Химические эксперименты. Различные тестовые реакции часто позволяют определить вероятность участия того или иного вещес ...