Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее про­стых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других объектах, не тре­бующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10-20 мкг вещества с точностью до 5-7%.

В зависимости от природы НФ тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки, выпускае­мые промышленностью, размером 5х15 или 20х20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3-5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств ана­лизируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пести­цидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто приме­няют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь Н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов - водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восхо­дящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит ком­поненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из каме­ры, отмечают линию фронта растворителя (обычно около 10 см) и высушива­ют.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине по­сле разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соеди­нения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люми­нофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде тем­ных пятен. Вещества, имеющие собственную флуоресценцию, также обна­руживают в УФ - свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характе­ру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей).

Величина Rf рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению

l

Rf

= , (3.3.1)

L

где l - расстояние от стартовой

линии до центра пятна, L - расстояние, пройденное за это же время растворителем (рис. 3.3.1).

Рис. 3.3.1. Хроматограмма двухкомпонентной смеси

а - а: линия старта, в - в : линия фронта растворителя

При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характер­ной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводи­мость значений Rf. На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю.

Copyright © 2024 - All Rights Reserved - www.chemicalnow.ru